A agarose é um polissacarídeo purificado de algas vermelhas ou algas marinhas. As moléculas de agarose são polímeros lineares longos de um dissacarídeo D-galactose repetido e 3,6-anidro-α-L-galactopiranose Uma molécula de agarose contém mais de cem subunidades. A agarose usada para eletroforese é altamente purificada. O processo de purificação remove os contaminantes que interferem nas enzimas usadas na clonagem molecular, como as endonucleases de restrição. O processo também gera uma preparação de agarose com propriedades eletroforéticas desejáveis e fluorescência mínima de fundo, o que é importante para a visualização de moléculas de DNA.
Agarose Kasvi: Está disponível em frascos de 100g e de 500g na forma de um pó branco, que pode ser usado para moldar géis para eletroforese de DNA
COMO PREPARAR GEL DE AGAROSE PARA TECNICA DE ELETROFORESE
A eletroforese em gel de agarose é uma técnica permite facilmente separar os fragmentos de DNA adequadamente amplificado pelo método de PCR. Dependendo do comprimento, os fragmentos permanecerão presos nas malhas formadas pela agarose, um polissacarídeo derivado especificamente de uma alga, que forma um gel.
Neste guia, explicaremos com como preparar o gel de agarose e como separar adequadamente suas amostras de DNA .
1-ITENS NECESSARIOS:
-CUBA DE ELETROFORESE HORIZONTAL 10 X 10 CM
-CUBA DE ELETROFORESE HORIZONTAL 15 X 15 CM
-CUBA DE ELETROFORESE VERTICAL 10 X 10 CM
-FONTE DE ELETROFORESE 300V
-MINI FONTE DE ELETROFORESE 300V. BIVOLT
-MINI FONTE ELETROFORESE 500V. BIVOLT
-TRANSILUMINADOR DE LED
-TRANSILUMINADOR UV 302 NM (312) 20 X 20 CM. BIVOLT
-AGAROSE PADRÃO. FRASCO 100 GRAMAS
-AGAROSE PADRÃO. FRASCO 500 GRAMAS
-MARCADOR DE PESO MOLECULAR 1 KB. FRASCO COM 500 ΜL
-MARCADOR DE PESO MOLECULAR 100 BP. FRASCO COM 500 ΜL
-CORANTE NÃO MUTAGÊNICO SAFER. FRASCO COM 1 ML
2-PREPARAÇÃO DO GEL
Primeiro de tudo você terá que preparar o gel de agarose; A preparação depende da quantidade de concentração de agarose necessária para separar os fragmentos de DNA amplificados com PCR. Por exemplo, se você precisar fazer isso a 1%, adicione 2 gramas de agarose em uma garrafa em 200 mL de tampão TBE 0,5. Leve a garrafa ao microondas, fervendo. Adicione o corante safer e agite bem, o gel está pronto para ser derramado. Deve ser derramado quente, porque à temperatura ambiente a agarose solidifica. Monte o aparelho para eletroforese, adicione os pentes e despeje a mistura para solidificar. Em seguida, adicione o TBE 0.5, que servirá como um buffer em execução. Antes de carregar as amostras de DNA, você precisará adicionar um espessante de corante, o tampão de carregamento, para cada uma delas.
3-Carregue a amostra
Carregue as amostras nos poços com a Micropipeta Kasvi, sempre trocando a ponteira ao passar de uma amostra para outra, para não contaminar. Deixe o primeiro poço vazio para carregar o marcador. Carregue o marcador, feche o aparelho por eletroforese e defina a voltagem apropriada para esse tipo de aparelho. Lembre-se de que os poços devem estar voltados para o pólo negativo do aparelho, pois, tendo o DNA carregado negativamente, os fragmentos terão que migrar em direção ao pólo positivo para se separarem.
4-Solidificação dos polímeros
Durante a solidificação, os polímeros de agarose se associam de forma não covalente e formam uma rede de pacotes, cujo tamanho de poro determina as propriedades de peneiração molecular do gel. O uso da eletroforese em gel de agarose revolucionou a separação do DNA. Antes da adoção dos géis de agarose, o DNA era principalmente separado por centrifugação com um gradiente de densidade de sacarose, o que fornecia apenas uma aproximação das dimensões. Para separar o DNA usando eletroforese em gel de agarose, o DNA é carregado em cavidades pré-moldadas no gel e uma corrente é aplicada. O esqueleto fosfato da molécula de DNA e RNA é carregado negativamente; portanto, quando colocados em um campo elétrico, os fragmentos de DNA migram para o ânodo carregado positivamente. Porque o DNA tem uma proporção uniforme de massa / carga. O principal modelo para o movimento do DNA através de um gel de agarose é uma “retificação parcial”, na qual a borda frontal avança e arrasta o restante da molécula.
5-Visualização das moléculas de DNA
A velocidade de migração de uma molécula de DNA através de um gel é determinada pelos seguintes fatores:
-Tamanho da molécula de DNA
-Concentração de agarose
-Conformação do DNA
-Tensão aplicada
-Presença de corante safer
-Tipo de agarose
-Tampão para eletroforese.
Após a separação, as moléculas de DNA podem ser visualizadas sob luz UV com um corante apropriado.
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